Sin embargo, cuando los espectros de emisión se superponen, se puede detectar la fluorescencia de más de un fluorocromo. Para corregir esta superposición espectral, se utiliza un proceso de compensación de fluorescencia. Esto asegura que la fluorescencia detectada en un detector en particular derive del fluorocromo que se está midiendo.
¿Por qué necesitamos compensación en la citometría de flujo?
Se requiere compensación para un experimento de citometría de flujo debido a la física de la fluorescencia. Un fluorocromo se excita y emite un fotón en un rango de longitudes de onda. Algunos de esos fotones se derraman en un segundo detector, lo que hace que las muestras individuales teñidas parezcan doblemente positivas.
¿Cuál es el propósito principal de usar una celda de compensación?
El objetivo principal es permitir la medición de la fluorescencia real en el canal principal contaminado por el desbordamiento de los fluoróforos vecinos. Por lo tanto, la compensación corrige el “traspaso” de fluorescencia entre fluoróforos. Sin embargo, no es perfecto y no puede solucionar todos los efectos indeseables.
¿Qué es la matriz de compensación?
Se calcula una matriz de compensación utilizando archivos de control fluorescente de un solo color que se recopilan en ImageStream o FlowSight con todos los canales recopilados y en ausencia de iluminación de campo claro o SSC.
¿Qué es la compensación espectral?
El uso de la compensación espectral significa que la señal de los detectores no primarios todavía se usa para mejorar la verdadera señal de los marcadores cuando sea posible. Las muestras de control primarias se utilizan para la denominación de parámetros. Las muestras utilizadas para detectores primarios también ayudan a nombrar esos parámetros después de la compensación espectral.
¿Cómo verifico mi compensación de FlowJo?
1) haciendo doble clic en la insignia de compensación de la ventana del espacio de trabajo (cualquier muestra compensada tiene esta insignia junto a la muestra en la columna de la izquierda en el espacio de trabajo). 2) haciendo clic en el botón “Ver matriz…” en la ventana principal de compensación .
¿Cómo se usa la compensación de FlowJo?
1) Para iniciar la creación de una nueva matriz de compensación en FlowJo, seleccione el grupo de compensación en el espacio de trabajo y vaya a la cinta del espacio de trabajo. 2) Haga clic en el icono de compensación en la banda Citometría de la pestaña Herramientas. 3) Se iniciará la interfaz de compensación.
¿Cómo reclamo una indemnización en FACS?
Procedimiento general
Asegúrese de que el citómetro esté funcionando dentro de las especificaciones utilizando perlas estándar.
Establezca los voltajes para los canales de fluorescencia utilizando una muestra sin teñir.
Si es posible, se deben evitar algunas combinaciones de fluorocromos (p. ej., APC y PE-Cy5), dado el alto grado de superposición de emisiones.
¿Cómo funciona la compensación FACS?
El término “compensación”, tal como se aplica al análisis de citometría de flujo, se refiere al proceso de corrección del desbordamiento de fluorescencia, es decir, la eliminación de la señal de cualquier fluorocromo dado de todos los detectores excepto el dedicado a medir ese tinte.
¿Qué es FITC y PE?
El estándar de compensación FITC/PE debe utilizarse junto con hardware o software para eliminar la superposición espectral de los fluorocromos en los detectores de fluorescencia secundarios de un citómetro de flujo. El estándar de compensación FITC/PE es una mezcla de 4 poblaciones de microesferas: FITC, PE, FITC/PE y AutoFluor™.
¿Cómo se hacen cuentas de compensación?
Procedimiento experimental
Etiquete un tubo para cada fluorocromo que se utilizará en el experimento.
Mezcle las perlas invirtiéndolas vigorosamente al menos 10 veces o agitándolas con un vórtex pulsado.
Etiquete cada tubo y pulse el vórtice 10 veces.
Agregue 1 gota de UltraComp eBeads a cada tubo.
Agregue 1 prueba o menos de conjugado de anticuerpos a cada tubo y mezcle.
¿Por qué usamos la citometría de flujo?
La citometría de flujo proporciona un método bien establecido para identificar células en solución y se usa más comúnmente para evaluar sangre periférica, médula ósea y otros fluidos corporales. Los estudios de citometría de flujo se utilizan para identificar y cuantificar las células inmunitarias y caracterizar las neoplasias malignas hematológicas.
¿Qué son los controles de compensación de la citometría de flujo?
Los controles de compensación adecuados incluyen un control negativo (se recomiendan células sin teñir) y un tubo de cada una de las células (o perlas) teñidas positivamente con cada uno de los fluorocromos utilizados en el experimento. Varios proveedores venden perlas específicamente para su uso como controles de compensación.
¿Cuál es la diferencia entre fluoróforo y fluorocromo?
Como sustantivos, la diferencia entre el fluorocromo y el fluoróforo es que el fluorocromo es cualquiera de los diversos tintes fluorescentes que se utilizan para teñir el material biológico antes del examen microscópico, mientras que el fluoróforo es (bioquímica) una molécula o un grupo funcional que es capaz de emitir fluorescencia.
¿Es la citometría de flujo FACS?
FACS es una abreviatura de clasificación de células individuales activadas por fluorescencia, que es una técnica de citometría de flujo que agrega un grado adicional de funcionalidad. La tecnología para clasificar físicamente una mezcla heterogénea de células en diferentes poblaciones es útil para muchas aplicaciones terapéuticas y clínicas.
¿Qué es la compensación de flujo?
La compensación de presión y temperatura (PT) convierte un flujo volumétrico de gas en condiciones específicas en un flujo volumétrico equivalente en condiciones base. Por lo general, no se usa la medición de densidad; otro enfoque es medir el peso molecular (en línea/fuera de línea) y luego compensar con el peso molecular de diseño.
¿Qué es el control de FMO en citometría de flujo?
Los controles Fluorescence Minus One (FMO) son muestras teñidas con todos los fluoróforos en su panel, menos uno de ellos. Se utilizan para establecer el límite superior para la señal de fondo en la etiqueta omitida y, por lo tanto, para identificar y seleccionar poblaciones positivas en experimentos multicolores.
¿Puedo hacer una compensación en FlowJo?
FlowJo le brinda la capacidad de compensar sus datos. Esto puede ser necesario en los casos en que la compensación se fijó de manera inapropiada durante la recolección de la muestra (aunque si la muestra se compensó en exceso, entonces no hay recurso).
¿Puedes ajustar la compensación en FlowJo?
FlowJo no permite la edición directa de la matriz de adquisición para mantener la integridad del estándar FCS, ya que estos valores de compensación se almacenan en el archivo. Por lo tanto, se debe crear una copia en FlowJo que se pueda editar.
¿Cómo reclamo Cytoflex?
Sugerencia rápida: para aplicar la compensación de forma retroactiva (comenzando primero con un experimento y luego aplicando la compensación), abra un experimento, ejecute sus muestras. Haga clic derecho en la muestra, aparece un cuadro “Aplicar compensación”.
¿Cómo accedes a FlowJo?
En la parte superior izquierda de la ventana de gráficos, verá un menú con una lista horizontal de iconos. Haga clic en la herramienta de rectángulo y mueva el mouse a la pantalla del gráfico. Haga clic y arrastre el mouse para generar un rectángulo. Nota: una vez que se haya configurado una puerta, aparecerá un menú que le pedirá que nombre la puerta.
¿Cómo elimino una matriz de compensación en FlowJo?
jo” y haga doble clic en él mientras se ejecuta FlowJo. Observe que cerca del área “1” hay una lista de matrices de compensación. Haga clic en una matriz de compensación, luego haga clic en el botón “-” para eliminarla.
¿Puede la citometría de flujo detectar células muertas?
La pérdida de integridad de la membrana es un indicador definitivo de muerte celular en los ensayos de citometría de flujo. Las células que excluyen un tinte de células muertas se consideran viables, mientras que las células con una membrana comprometida permiten que el tinte dentro de la célula manche un componente interno, identificando así a la célula como muerta.