Los anticuerpos de control de carga son controles importantes, ya que indican la misma carga de muestras en todos los pocillos. Los controles de carga también indican la transferencia adecuada de proteínas a la membrana durante el proceso de transferencia Western. Los controles de carga son típicamente proteínas con expresión alta y ubicua.
¿Qué hace un control de carga?
Un control de carga es una proteína utilizada como control en un experimento de transferencia Western. Se utilizan para asegurarse de que la proteína se haya cargado por igual en todos los pocillos.
¿Por qué usamos un control de carga en Western blot?
Los controles de carga tienen un segundo papel como control en los western blots. Se pueden utilizar para comprobar que se ha producido una transferencia uniforme del gel a la membrana en todo el gel. Esto es imperativo cuando se realizan comparaciones de los niveles de expresión de proteínas entre muestras.
¿Cómo se usa el control de carga en Western blot?
Las señales de los controles de carga se utilizan normalmente para normalizar las señales de las proteínas de interés. Para usar un control de carga para estos fines, la detección con el anticuerpo de proteína de control y el anticuerpo experimental deben realizarse en la misma transferencia. Se utiliza una variedad de proteínas diferentes como controles de carga.
¿Por qué se utiliza la actina como control de carga?
La beta-actina generalmente se usa como control de carga para Western Blot para normalizar los niveles de proteína detectados al confirmar que la carga de proteína es la misma en todo el gel.
¿Es Gapdh un buen control de carga?
GAPDH (36 kDa) es integral para la glucólisis y desempeña muchas funciones en la función nuclear; como la regulación de la transcripción y la apoptosis. La expresión estable y ubicua de GAPDH también lo convierte en un control de carga adecuado para muchos experimentos.
¿Cómo elijo un control de carga?
Tamaño de detección: un control de carga debe tener un peso molecular sustancialmente diferente al de su proteína de interés. Nivel de expresión: elija un control de carga que demuestre una fuerte expresión en la muestra de interés.
¿Cuánta proteína debo cargar en un western blot?
Asegúrese de cargar al menos 20–30 µg de proteína por carril, use inhibidores de la proteasa y ejecute el control positivo recomendado. Utilice un paso de enriquecimiento para maximizar la señal (por ejemplo, preparar lisados nucleares para una proteína nuclear). El uso excesivo de anticuerpos ha reducido su eficacia.
¿Por qué se utiliza tubulina como control de carga?
La beta-tubulina generalmente se usa como control de carga para Western Blot para normalizar los niveles de proteína detectados al confirmar que la carga de proteína es la misma en todo el gel.
¿Por qué se usa la proteína de limpieza en el western blot?
Las proteínas de limpieza se utilizan como proteínas de referencia para normalizar la proteína diana durante el análisis de transferencia Western. Por lo tanto, para comparar con precisión las señales de Western Blot, se deben compensar estas variaciones en la intensidad de la señal no relacionadas con la muestra.
¿Qué es la técnica de western blot?
Un western blot es un método de laboratorio utilizado para detectar moléculas de proteínas específicas de entre una mezcla de proteínas. Esta mezcla puede incluir todas las proteínas asociadas con un tejido o tipo de célula en particular. Después de la separación, las proteínas se transfieren del gel a una membrana de transferencia.
¿Cuál es el propósito de un control de carga en western blot? Enumere dos controles de carga comunes y explique por qué se usan como controles de carga.
Los controles de carga sirven para numerosos propósitos en una investigación de Western blot. Básicamente, se utilizan para normalizar los niveles de proteína detectados en una muestra al garantizar que la carga de proteína sea la misma en todo el gel.
¿Un control de carga muestra normalización?
Los controles de carga proporcionan un medio para garantizar la misma carga de proteínas en todos los pocillos, así como un punto de referencia para la normalización de datos.
¿Qué es un control de carga MCAT?
520: 131/126/132/131. 1 año El control de carga se usa para mostrar que cargó cada pocillo correctamente con la concentración estandarizada de proteína. El control positivo se refiere más a las condiciones experimentales reales que a asegurarse de tener una preparación correcta del ensayo.
¿Qué es un control de carga en Northern blot?
Los controles de carga son esenciales para la interpretación adecuada de los western blot. Se utilizan para normalizar los niveles de proteína detectados al confirmar que la carga de proteína es la misma en todo el gel. Los niveles de expresión del control de carga no deben variar entre los diferentes carriles de muestra.
¿Cuáles son los dos tipos de membrana que se emplean habitualmente para el Western Blot?
Membranas secantes. Las membranas de inmovilización más comunes para el Western Blot son la nitrocelulosa, el difluoruro de polivinilideno (PVDF) y el nailon. Estas membranas se usan comúnmente porque ofrecen: Gran relación de área de superficie a área de volumen.
¿Qué es la β tubulina?
La tubulina β, la proteína a la que se unen todos los agentes clínicos que alteran los microtúbulos, está codificada por múltiples genes y representada por varios pseudogenes. Al menos siete isotipos diferentes de β-tubulinas (clases I-VII) se expresan diferencialmente en células humanas.
¿Los controles de carga necesitan réplicas?
Creo que no necesitamos duplicar los geles. Un solo gel es suficiente para mostrar los resultados. Si usa b-actina como control de carga para referirse a sus muestras, debe detectarlo en el mismo gel para obtener el resultado correcto.
¿Cuál es la brecha para la tubulina β?
El dímero de tubulina se forma cuando los monómeros de tubulina alfa y beta se unen con GTP (4). Dentro del dímero, la tubulina alfa actúa como una proteína activadora de GTPasa (GAP) para la tubulina beta, y la tubulina beta actúa como una proteína G, una proteína con actividad GTPasa intrínseca (4).
¿Por qué no hay bandas en mi Western blot?
Causas posibles y soluciones de Western Blot para la falta de bandas El nivel de expresión de la proteína puede ser demasiado bajo, así que simplemente aumente el volumen de la proteína cargada; El bloqueo excesivo dificulta la visualización de la proteína objetivo, por lo tanto, reduzca la concentración de leche descremada de manera adecuada o acorte el tiempo de bloqueo.
¿Por qué mi Western Blot está tan sucio?
Fondo manchado, moteado o sucio Estos artefactos suelen ser el resultado de una capa desigual de tampón o anticuerpo, de la desecación de la membrana o de la formación de agregados en el anticuerpo o el tampón de bloqueo.
¿Cómo se diluye la proteína para el Western Blot?
El extracto de proteínas no debe diluirse demasiado para evitar la pérdida de proteínas y la carga de grandes volúmenes de muestras en los geles. La concentración mínima recomendada es de 0,1 mg/mL, la concentración óptima es de 1 a 5 mg/mL). Centrifugar durante 20 min a 12.000 rpm a 4 °C en una microcentrífuga.
¿Qué es el control positivo en Western blot?
Un lisado de control positivo es un lisado de una línea celular o muestra de tejido que se sabe que expresa la proteína que está detectando. Un resultado positivo del control positivo, incluso si las muestras son negativas, indicará que el procedimiento está optimizado y funcionando. Verificará que cualquier resultado negativo sea válido.
¿Cómo se lee un Western blot?
Busque los tamaños de las bandas. Estos estarán representados por un número, ya sea seguido por “kDa” o precedido por “p”. Este es el tamaño de la proteína que se ha detectado y es la escala en la que se separan las proteínas en un Western blot.
¿Qué tamaño es Gapdh?
GAPDH es un tetrámero de 146 kDa compuesto por cuatro subunidades de 30-40 kDa.